Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота

2.
Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого
скота

2.1. Реакция
иммунодиффузии (РИД).

2.1.1. Сущность
метода.Метод основан на
обнаружении в сыворотке крови животных специфических
преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного
рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8
недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме
пожизненно.

https://www.youtube.com/watch{q}v=upload

2.1.2. Серологическому
исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и
старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30
суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных
животных — за 30 суток до отела или через 30 суток после него.

2.1.3. Получение
сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого
животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с
сопроводительным документом, в котором указывают название
хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.Кровь (для получения
сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в
теплом месте (не выше 40°С).

Для лучшего отделения сыворотки
образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после
каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки
выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы
сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и
маркируют.


стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;-
пипетки пастеровские или автоматические со сменными
наконечниками;-
рН-метр;-
осветитель;-
хлорид натрия (х.ч.);-
дистиллированная вода.

2.1.5. Постановка
РИД.Подготовку компонентов
реакции к работе осуществляют в соответствии с «Наставлением по
применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного
рогатого скота». Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят
при температуре 4°С не более двух недель.

Разбавитель ССА и солевую
смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до
объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и
выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный
агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм
(12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми
при комнатной температуре в течение 1 ч.

Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота

После застывания агара
специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская
образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В
каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из
семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой
лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и
периферическими лунками — 3 мм.

Прочитайте также:  Яблоня Уэлси: описание сорта и фото

Образовавшиеся диски геля удаляют
из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.Антиген, контрольные и
испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или
автоматическими пипетками со сменными наконечниками.Антиген (А) вносят в
центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют
контрольной сывороткой (КС).

2.1.6. Учет и оценка
результатов реакции.

2.1.6.1. Реакцию
учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч.
Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч
осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции
оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует
или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия
преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и
антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на
одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной
сывороткой.Неспецифической считают
линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой
сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией
преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя
угол.

2.1.6.2. Оценка
результатов.В
зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС
в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или
отрицательную.Положительной считают
реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой
образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой
преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то
есть идентична ей (рис.

1 — не приводится, поз.1):-
если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и
антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей
сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб,
направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), —
слабоположительная сыворотка;


если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с
испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном
или образует линию преципитации, расположенную очень близко от
лунки с антигеном (рис.1, поз.2), — резко положительная
сыворотка.Положительно реагирующая
сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая
располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой.

Эта линия
указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против
второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).При образовании толстой,
короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей
до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку
этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата,
который можно будет оценить как отрицательный, положительный или
неспецифический.

Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Для этого необходимо физиологический раствор в
объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных
пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество
пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В
первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем
сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том
же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания
— в следующую и т.д.

Прочитайте также:  Тракененская порода лошадей: характеристика и фото

https://www.youtube.com/watch{q}v=ytadvertise

В результате в первой пробирке или лунке
испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй — в 4 раза, в
третьей — в 8 раз и т.д.Реакцию считают
отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с
испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).В
случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется
зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

2.1.7. Животных,
сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД,
признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать
гематологическим методом.

2.2. Метод
иммуноферментного анализа (ИФА).

2.2.1. Сущность метода.
Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции
взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве
индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или
антигенов.Существует две
модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.Метод непрямого
иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к
вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на
стенках лунок планшета для микротитрования.

Связавшиеся антитела
выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом
(пероксидазой), с последующим ферментативным превращением
бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт.
Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к
ВЛКРС в сыворотке крови.В
основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность
антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать
связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными
(адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования
(МТП).

Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами,
выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой
(конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного
превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт.
В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС,
интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в
испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо
пропорционально их содержанию.

2.2.2. Материалы и
оборудование.

Прочитайте также:  Как плести корзины из ивы своими руками пошагово. Плетение корзины из ивы своими руками для начинающих: схема, фото. Плетение корзин из ивы и лозы

2.2.2.1. Материалом для
исследования методом иммуноферментного анализа может служить
сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и
молоко.При исследовании
сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки
пригодны для использования в течение 10 дней при температуре
хранения 4°С.

Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота

2.2.2.2. При постановке
реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы
согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.Для проведения
исследования применяют:-
микропипетки одноканальные автоматические;-
микропипетки 8- или 12-канальные автоматические;-
фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией
результатов.

https://www.youtube.com/watch{q}v=ytabout

Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный
фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;-
микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96
лунками;-
автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания
пластин;-
термостат, обеспечивающий температуру 37 /-0,5°С;-
стаканы химические;-
колбы мерные;-
колбы Эрленмейера;-
пробирки;-
пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Энциклопедия садовника
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!:

Adblock detector